1、內(nèi)標(biāo)對熒光定量PCR儀的影響
若在待測樣品中加入已知起始拷貝數(shù)的內(nèi)標(biāo)，則 PCR 反應(yīng)變?yōu)殡p重 PCR，雙重 PCR 反應(yīng) 中存在兩種模板之間的干擾和競爭，尤其當(dāng)兩種模板的起始拷貝數(shù)相差比較大時，這種競爭會表現(xiàn)得更為顯著。但由于待測樣品的起始拷貝數(shù)是未知的，所以無法加入合適數(shù)量的已知模板作為內(nèi)標(biāo)。也正是這個原因，傳統(tǒng)定量方法雖然加入內(nèi)標(biāo)，但仍然只是一種半定量的方法。
2、熒光定量 PCR 無需內(nèi)標(biāo)定量
熒光定量PCR儀技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點檢測的局限，實現(xiàn)了每一輪循環(huán) 均檢測一次熒光信號的強(qiáng)度，并記錄在電腦軟件之中，通過對每個樣品 Ct 值的計算，根據(jù) 標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。實時熒光定量 PCR 無需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個基礎(chǔ)之上的：
?。?）Ct 值的高度重現(xiàn)性 PCR 循環(huán)在到達(dá) Ct 值所在的循環(huán)數(shù)時，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對數(shù)期），此時微小誤差尚未放大，因此 Ct 值的重現(xiàn)性*，即同一模板不同時間擴(kuò)增或同一時間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的 Ct 值是恒定的。
?。?）Ct 值與起始模板的線性關(guān)系由于 Ct 值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知樣品進(jìn)行定量測定， 因此，實時熒光定量 PCR 是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。
外標(biāo)法定量和內(nèi)標(biāo)法定量的方法學(xué)比較，得出的結(jié)論是：內(nèi)標(biāo)法作為定量或半定量的手段是不可靠的，而外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。熒光定量PCR儀
